摘要 使用甾体类药物和抗炎药物治疗炎性肠病(IBD)时常产生不良反应或不能达到痊愈，所以IBD的生物治疗，包括基因转移疗法就提到日程上来。本综述简要的概括了IBD相关的基因治疗靶向分子，而且总结了近期肠道基因治疗临床前研究的结果并讨论了未来的发展方向。
关键词 炎性肠病 克罗恩氏病 溃疡性结肠炎 转基因 动物模型
［前言］克克罗恩氏病(Crohn)和溃疡性结肠炎(UC)作为IBD的两大分支，它们的发病是遗传因素、环境影响和免疫状态之间复杂相互作用的结果。这些顽固性疾病的病因仍不清楚。其经典的治疗方法不能取得满意疗效。很长时间以来，基因治疗常用来治疗单基因病，以治疗性的基因替换有缺陷的同组基因。现在基因治疗的对象已经扩展至多基因病如IBD，通过表达具有下调病理基因或诱导保护性免疫反应功能的免疫相关蛋白而起作用。转基因治疗IBD的发展还只是处于起步阶段，相对于囊腺纤维化，重度联合免疫缺陷病及各种癌症来说迄今为止还没有大规模的临床试验。因为Crohn病和UC是由多种因素引发的，对于他们的基因治疗就要求我们对缺陷基因，靶细胞，合适的DNA载体系统及靶向导入方式有进一步的认识[1]。本综述就与IBD有关的基因治疗靶向分子作简单的叙述。同时总结了动物研究中基因治疗的新成果，并讨论未来的发展方向。
1． 炎性肠病发病的分子机制及最新疗法
最近有资料表明Nod2（CARD15）基因的变异与克罗恩氏病的易感性相关。Crohn病主要是Th1相关的致炎性细胞因子和抗炎性胞因子失衡引起的。,致炎因子TNF-a在Crohn病的发病起主要作用，其生物拮抗剂对克罗恩氏病有临床疗效。TNF-a生物拮抗剂包括人鼠嵌合单克罗恩氏抗体Infliximab（因福利美）和人基因重组单克罗恩氏抗体CDP571[2]
。 UC则以Th2免疫应答为主，促进体液免疫过程。一些对动物肠炎模型有疗效的免疫生物制剂正在临床试验阶段:白细胞黏附分子的单克罗恩氏抗体（整合素a4，a4b7），细胞因子/细胞因子受体（IL-12，IL-2受体），重组细胞因子（IFN-a-2A,IFN-b1a）以及NF-kBP65亚单位的反义寡核苷酸。有些生物制剂在临床
试验中已证明无效或疗效有限如重组IL-10,黏附分子ICAM-1的反义寡核苷酸[3]。同时造血干细胞移植治疗IBD也已经积极开展[4.5]。但是，这些新疗法有可能同经典疗法合用，而不能，至少近期不能单独作为IBD的治疗方式.
2．治疗基因导入消化道
由于肠道隐窝中有大量的干细胞，肠腔又看似易于给药，肠道成为基因治疗的一个靶位。然而实际上将基因导入肠壁并非易事。要达到基因治疗IBD的目的，以肠淋巴组织的免疫细胞为靶向有应用前景。由于基因治疗的载体进入肠腔后，上皮细胞屏障阻碍了黏膜下层的有效转染，所以需要采用其他给药途径或者专门的基因载体系统来靶向富集基底膜﹑肠系膜淋巴结和回肠Pey’s结的单核细胞。
最近Ye等为小鼠暂时构建肝脏旁路，然后将重组病毒颗粒注射给药。此种肠道基因治疗，增加了肠壁血管及毛细血管细胞内信号基因的表达，可持续几周[6]。人类以及啮齿类的细胞组系和动物模型的体内外研究表明：局部应用微脂粒，反转录病毒﹑痘病毒﹑腺联病毒以及腺病毒载体系统转染肠黏膜是可行的，而且溶解黏液的物质（二巯基苏糖醇，N－乙酰半胱氨酸，Nacystelyn）可明显提高转染效率。总的来说，最有前景的胃肠道基因转导系统是一种依赖辅助性缺少读码框的重组腺联病毒。During等研究发现一次性经口饲管给禁食大鼠腺联病毒后在胃，十二指肠和小肠都有长期表达，应用此种方法进行接种，成功产生了识别特定脑蛋白的自身抗体。在这项研究中，经口饲药却没有引起结肠细胞的转染，但直肠给药可能有效[7]。
多数的体内试验应用有复制缺陷的Ad5病毒载体，这种载体是能非常有效的进入多种真核细胞，但是与反转录病毒不同，既感染分裂细胞，也感染非分裂细胞。应用腺病毒灌肠引起结肠黏膜的有效转染。然而肠内灌注转染的细胞多数是吸回的肠上皮细胞,因为肠上皮细胞的迅速更新.腺病毒介导的基因表达很短暂，2－3天后就大幅度降低。不过重复给药能够延长基因表达，肠腔内给药不但不引起全身的抗体反应还不增强免疫反应。陈等通过直接注射重组Ad5，将基因成功导入Pey’s结[8]。
3、肠道干细胞
肠道上皮细胞随粪便不断流失，必须有迅速分裂的多能干细胞提供补充。干细胞是基因治疗的最佳目标。改变肠道干细胞的遗传信息对于包括IBD在内的许多胃肠道疾病有显著的临床价值。可惜的是肠道干细胞没有确切的细胞标志物，因此不能把它们同其他的上皮细胞区分开来。现在还没有将基因转入干细胞的直接证据，然而给药后重组基因在肠道上皮细胞长时间表达很可能需要肠道干细胞的稳定转导。肠道是高效率病毒感染的天然宿主，腺联病毒介导肠道干细胞的转导有很大潜力。对小鼠静脉注射重组腺病毒，发现结肠上皮隐窝细胞稳定表达重组基因，而消化道的其他部分则没有信号基因表达。由于对病毒成分产生的免疫反应会将被转染的细胞清除，故此现象只在免疫缺陷的小鼠中观察到。这项结果令人惊异之处在于，腺病毒全身给药不能有效转导结肠细胞，而且Ad5是不易整合入宿主基因组的。近来肠道干细胞研究的发展，尤其是成年原代肠道上皮细胞体外培养方法的进步，使详细研究以及试验性培育干细胞成为可能。在将来，体外转染肠道干细胞而后移植可能成为基因导入的重要方法[9],近来，HSCT成功治疗IBD，随访24个月至34个月未复发(CAID﹤100),为其发展开辟了道路[4.5]。
在将基因导入基底层的免疫细胞和派氏结的过程中，M细胞能够迅速将重组基因呈递给基底层的免疫细胞［10］。
4．病毒载体介导的基因治疗改变免疫调节型细胞因子的水平以治疗人类炎性肠病的动物模型的炎症
在健康肠道内，免疫细胞和非免疫细胞的相互作用受到严格的动态调节，以确保宿主和共生肠腔微生物群之间的免疫平衡。这些相互作用主要依靠免疫细胞和其他细胞（如上皮细胞）之间的信息交流。这种交流可通过细胞表面受体的直接作用，也可借助释放可溶性介质，如细胞因子。现在已经证明克罗恩氏病和UC患者的肠腔中，致炎型细胞因子和调节型细胞因子的平衡被打乱。克罗恩氏病中，一些致炎型细胞因子在组织损伤中扮演重要角色。相对而言，许多动物研究表明：调节型细胞因子对抗原呈递和致炎因子的释放有抑制作用，对活性免疫细胞凋亡有促进作用，在免疫平衡中至关重要。因为他们在正常和炎性肠道中的重要作用，发展新疗法主要集中在改变T细胞相关细胞因子的生理功能上。在这里简单总结一下围绕细胞因子开展的基因治疗在以IBD为模型的动物研究中取得的成果。
4.1 靶向致炎型细胞因子
基因治疗是IBD中导入致炎型细胞因子拮抗剂的重要方法。最近研究表明，Crohn病患者的炎性肠黏膜中活性IL-18有所上调，IL-18是一种多效性细胞因子，与IL-1家族的结构相似，最初被定义为IFN-g诱导因子。IL-18对不同免疫细胞功能是多元化的，而且协同IL-12引发Th1免疫反应。在T淋巴细胞中，IL-18激活转录因子NF-kB和AP-1，协同IL-12诱导的转录因子STAT启动IFN-g的转录。除此之外，IL-18通过上调致炎因子TNF-a，IL-1，IL-6增强免疫反应。由此认为IL-18可能是与Th1相关的炎性疾病（包括Crohn病在内）的主要病理因子[11]。由于以IBD为模型的小鼠肠粒细胞和上皮细胞内IL-18水平都有升高，Neurath研究组探索了用IL-18基因治疗IBD的可行性［12］。
Neurath研究组用E1/E3缺陷的重组Ad5作为载体，用巨细胞病毒启动子介导表达IL-18反意RNA。在C.B-17
SCID小鼠T细胞介导的慢性肠炎模型中，在给药后第6天，杀死小鼠进行分析。结果表明，灌注反意IL-18组内源性IL-18蛋白水平显著低于对照组。［13］。
4.2过量表达调节型细胞因子
除了靶向致炎型细胞因子之外，过量表达调节型细胞因子可能也有治疗价值。一些基因治疗载体已经被成功用于导入调节型/抗炎型细胞因子IL-10和TNF-b，以治疗人类炎症或自身免疫病的动物模型[14]。
最近，Kitani等以单剂量经鼻给予裸露的质粒DNA介导表达转化生长因子β（TGF- b)前肽，在肠道中检测到重组TGF-
b 1的表达。TGF- b 1的转导预防了小鼠试验性肠炎的形成，并且有效减轻了已有肠炎的症状。肌注表达TGF-
b 1的质粒也对大鼠肠炎有疗效。［15］。
IL-10基因缺失的小鼠产生自发性重度慢性结肠炎，而且IL-10促进抗原特异性调节型T细胞的形成。由于重组IL-10对数个动物模型的肠炎治疗有效，而且腺病毒介导的IL-10转导成功治疗了小鼠风湿性关节炎（风湿性关节炎在免疫生物学上与Crohn病很相似），因此学者对基因转导提高炎性肠道IL-10水平的可行性进行了评估。三组试验分别以大鼠，小鼠或IL-10缺失小鼠的试验性TNBS肠炎为模型，均证实Ad5介导的IL-10转导以全身给药能够预防结肠炎症。但是已发疾病的治疗研究只能在IL-10缺失小鼠身上进行。IL-10由通过基因修饰能够分泌IL-10的乳酸菌带到小肠黏膜。每日通过口饲管给乳酸菌对于IL-10缺陷小鼠和右旋硫酸钠诱导的肠炎有显著的临床疗效。可是在临床试验中静脉注射重组IL-10对活动性克罗恩氏病只有中等疗效，而且大剂量IL-10甚至能诱导致炎因子IFN-g的生成。近来，Montfrans等用逆转录病毒体外转染CD4+T淋巴细胞表达IL-10。这些细胞可以长时间持续产生活性IL-10(>4个月)，能够表达介导肠道趋向性的整合素a4
b 7，并具有免疫调节型的表型。这种转染了IL-10的T细胞被成功用于治疗CD4+CD45RBHighSCID模型。可以想象，局部输送稳定生成IL-10的调节型T细胞会得到比直接注射IL-10更令人满意的临床疗效。总之，IL-10在动物IBD中的治疗经验是令人鼓舞的，但IL-10基因治疗是否适于人类IBD还有待探察［16］。
局部环境的细胞因子决定了新生CD4+T淋巴细胞的亚型分化方向。CD4+T的两个主要亚型生成不同的细胞因子。Th1细胞主要产生大量的IL-2和IFN-g，而Th2细胞产生IL-4,IL-5,IL-10和IL-13。因为Th1细胞与克罗恩氏病的病理机制有显著联系，Hogaboam等研究了腺病毒介导表达重组IL-4对大鼠试验性肠炎的影响。IL-4是Th2细胞的分化因子，腹腔注射引起全身以及结肠局部IL-4水平增高，减轻急性结肠炎症。相反，在一例小鼠的慢性肠炎模型中，外源性的IL-4加重病情，说明IL-4在肠免疫系统中并不是简单的抗炎作用。除此之外，尽管几个人类炎性肠病的动物模型有截然不同的Th1反应和Th2反应，UC的情况还不完全清楚。
5、结束语
综上所述，很多有前景的临床前研究已经将治疗性基因有效转入动物炎性肠腔。然而，基因转导载体引发的自身或获得性免疫防御机制会防碍转入基因的长期表达，而且大剂量能引起全身性不良反应。作为一种新的治疗炎性肠病的方式，通过改变亲和性的载体或运用有效而特异的靶向肠道细胞可能有益于介导基因的转移。我们最终的结论是：
（1）转基因治疗IBD最终应用于临床时患者群选择及可能的并发症还没有预测。
（2）临床前研究表明，用不同的病毒和非病毒载体系统介导肠道靶向给药是可行的。骨髓干细胞移植对IBD也有益。
（3）过量表达调节型细胞因子（IL-10,TGF-β）或抑制致炎型细胞因子（IL-18）的表达在动物试验中有疗效。
参 考 文 献
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